CONSTRUCTION OF A RECOMBINANT PLASMID CARRYING THE MATRIX GENE OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS FOR DIAGNOSTIC APPLICATIONS

Abstract

Newcastle disease virus (NDV) remains a major threat to poultry production worldwide, requiring reliable molecular diagnostic tools. In this study, a recombinant plasmid carrying the matrix (M) gene of NDV was constructed and characterized for potential use as a positive control in PCR-based diagnostic systems. Viral RNA was isolated from the LaSota vaccine strain, followed by cDNA synthesis and amplification of a ~1100 bp fragment of the M gene using high-fidelity polymerase. The amplified product was cloned into the pJET1.2/blunt vector and subsequently subcloned into the pMAL expression vector. Recombinant constructs were transformed into Escherichia coli DH5α cells and confirmed by colony PCR, restriction analysis, and agarose gel electrophoresis. The presence of the insert was verified by the expected fragment sizes after enzymatic digestion. The resulting recombinant plasmid demonstrated stability and suitability for further applications. The constructed pMAL-M plasmid can serve as a reliable positive control for NDV molecular diagnostics and provides a platform for future studies on M protein expression and functional analysis. These findings contribute to improving the accuracy of NDV detection and support further development of molecular diagnostic tools. Вирус болезни Ньюкасла (NDV) остается одной из наиболее значимых инфекций птиц, требующей разработки надежных молекулярных методов диагностики. В данной работе была сконструирована и охарактеризована рекомбинантная плазмида, содержащая ген матриксного белка (M) NDV, с целью ее использования в качестве положительного контроля в ПЦР-диагностике. Вирусную РНК выделяли из вакцинного штамма LaSota, после чего проводили синтез кДНК и амплификацию фрагмента гена M размером около 1100 п.н. с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Полученный ампликон клонировали в вектор pJET1.2/blunt с последующим субклонированием в экспрессионный вектор pMAL. Рекомбинантные конструкции трансформировали в клетки Escherichia coli DH5α и подтверждали методом colony PCR, рестрикционного анализа и электрофореза в агарозном геле. Наличие вставки подтверждено соответствием размеров фрагментов ожидаемым значениям. Полученная плазмида продемонстрировала стабильность и пригодность для дальнейшего использования. Конструированная плазмида pMAL-M может применяться в качестве надежного положительного контроля в молекулярной диагностике NDV, а также служит основой для дальнейших исследований экспрессии и функциональных свойств белка M. Полученные результаты способствуют повышению точности диагностики и развитию молекулярных тест-систем.